2017年H5亞型禽流感流行毒株變異情況研究及分析

摘要：H5亞型禽流感2.3.4.4分支（zhī）病毒已流行了（le）幾年，當前的流行毒株是否會因（yīn）變異而導致免疫失敗（bài）引起關注。本研究對近年來流行毒株進行（háng）測序，比（bǐ）較分析了（le）其抗原位點（diǎn）的變異情況，結果發現2017年的流行（háng）毒（dú）株已發生較大的變異，形成了一個獨立的分支（zhī），與其之（zhī）前的毒株HA核苷酸序列的差（chà）異達4.4%-5.4%。其最大（dà）特征是（shì）HA蛋白的142位E（按（àn）A/Goose/Guangdong/1/96毒株排序）發生缺（quē）失，導（dǎo）致該處（chù）增加了1個糖基化位點；同時受體結合位點的口袋右（yòu）緣發生L145S的變異，而這一位點（diǎn）變異時間在2016年的毒（dú）株就（jiù）已產生；2017的毒（dú）株（zhū）另有12個aa發生了較為一（yī）致的變異。故推測當前毒株的抗原性已發（fā）生了較大變化。但238位（H3排序226位）勻為（wéi）Q，保持禽源毒株的特（tè）征。需采取增加疫苗免疫頻次及劑量，強化生物安全措施加以防控（kòng）。

H5亞型離流感自（zì）1996年發現以來已流行了20多年，給養禽業造成了巨大的損失，同時對公共衛生構成（chéng）了（le）嚴重（chóng）威脅。病毒在這其間發生了多（duō）次的變異，產生了0-9分支，共10個不同分支的毒株。每間（jiān）隔3-4年H5亞型流感病毒發（fā）生1次（cì）新的優勢流行毒株的更疊，疫苗也隨之不斷更換。當前（qián）流行毒株主要為2.3.4.4分支，與（yǔ）其（qí）相對應的疫苗為Re-8疫苗，該分支毒株由2008年（nián）出現的2.3.4分支進化而來，2014年（nián）在韓國、越南等國流行以來, 已（yǐ）有幾年，近期生產上（shàng）也有免疫失敗情況增多（duō）的反映，當（dāng）前流行毒株是否（fǒu）發生了變異，引起（qǐ）特別關注。本研究選取日常監測中發現的陽性樣測序結果進行分析，旨在了解當前毒株的變異情（qíng）況，指導（dǎo）生（shēng）產與防控工作（zuò）。

1、材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品：拭子樣品8份，不同年份的采集於活禽交易（yì）市場（chǎng）。

1.1.2 試劑（jì）：抽提試劑RNAiso Reagent、一步法RT-PCR擴增試劑（PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit ），購自寶生物工程（大連）有限公（gōng）司。

1.1.3 HA基（jī）因的擴增引物：上遊引物P1：5`-CAGGGAGCAAAAGCAGGGGTYCAAT-3`；下遊引物P2：5`- GGTGGATTCTCTGTCTGCAGCGTAC-3`，P3: 5`-CTACTAGATCCCAAGTAAACGGGCAAC-3`；下遊引物P4：5`-AGAAACAAGGGTGTTTTTAAYTACAAT-3`，上（shàng）海立菲生物工程有限公司合成（chéng）。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提（tí）取：按抽提試（shì）劑操作（zuò）說明書進行。

1.2.2 HA基因（yīn）擴增體係與程序：上、下遊引物(25μM)各1μL、2×Bμffer 25μL、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2μL 、DEPC水11μL和所提取的病毒RNA 10μL，體係共50μL，反應程序為50℃ 30min，95℃ 2min，然後95℃ 30s、53℃ 30s、72℃ 2min，30個循環，72℃延伸8min。

1.2.3 序（xù）列測定和分析

將PCR產物送上海立菲生（shēng）物工程（chéng）有限公司進行測序，結果（guǒ）用DNAstar軟件進行序列拚接。並與下載自GenBank 的禽流感病毒（dú）祖先代表株A/goose/donguan//2017/H5的HA基因（yīn）組序列進行比較, 采用MEGA 5.0軟件繪製其（qí）HA因組的係統進化樹。

2、結果與分析

2.1 HA 基因擴增結果（guǒ）

擴增出大小分別為1191bp和1057bp的特異性條帶，與設計預期相符。見圖1。

圖1  PCR擴增結果（guǒ）

M、DNA Marker DL2000；1-8、P1P2擴（kuò）增結果（guǒ）；9-16、P3P4擴增結果

2.2 HA基因遺（yí）傳進化分析（xī）

將2017年的毒株（zhū）A/goose/donguan//2017/H5，通過與Genbank上收（shōu）錄的序列（liè）進行比較，結果相似性最高的為KY415645(A/chicken/Ganzhou/GZ21/2015/H5N6)，二者核苷酸的相似性為98%。從進化樹可以看出（chū）近年毒株可分為2個分支。其中2017年的3個株毒已形成一個獨立的分（fèn）支；2013-2016年形成另一個分支，該分（fèn）支各毒株間也有一定的（de）差異（yì），但不同年份毒株的差異不具有時間規（guī）律性。與最（zuì）早（zǎo）出現的高致性H5代表株（zhū）A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)相比有較大的（de）差異（yì），見圖2。當前最新的2017年（nián）毒株與A/Goose/Guangdong/1/96相比，核苷（gān）酸差異已（yǐ）達10.1%-10.2%，與2016年毒（dú）株相（xiàng）比差異性為4.2%-4.8%，與（yǔ）2015年毒株相比差異性為5.1%-5.4%，與2014年之前的毒株相比差異性為（wéi）4.4%-4.5%。2017年3個毒株間的差異較小，僅為0.4%-0.7%。2016年以前的毒株間的差異相對（duì）較（jiào）小，2.1%-3.8%。

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