塞尼卡穀病（bìng）毒（dú）重組酶聚合（hé）酶擴增技術（shù）（RPA）實時熒光檢測方法的建立

摘要（yào） ：塞尼卡穀病毒（Seneca valley virus，SVV）可（kě）感染豬，引起類似口蹄疫病毒感染造成的水皰性病（bìng）變，新生（shēng）仔（zǎi）豬病死率達 30%~70%。本研究利用重組酶聚合（hé）酶（méi）擴（kuò）增技術（RPA），針（zhēn）對 SVV 3D 基因設計了引物和探針，並進行篩選、反應條件優化以（yǐ）及敏感性（xìng）、特異性和重複（fù）性試驗，建立了實時熒光 RPA 方法。結果顯示，本方（fāng）法（fǎ）在 40 ℃、10 min 內檢測的最低濃度（dù）為 28 拷（kǎo）貝 /µL ；與口蹄疫病（bìng）毒、豬瘟病毒、豬（zhū）繁（fán）殖與呼吸（xī）綜（zōng）合征病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒無交叉反應 ；通過 3 次重複試驗檢測 2.8×106~2.8×101 拷貝 /μL 的 6 個（gè）稀釋度樣品，在熒光強度達（dá） 1 500 mV 所（suǒ）需時間變（biàn）異係數範圍在 2.44%~14.95%。該（gāi）等溫、快速（sù）擴（kuò）增方法為豬群出現水皰性疾病的（de）鑒別診斷提供了技術支持，對及時采取適當防控措施具有重要意（yì）義。

塞（sāi）尼卡穀病毒（Seneca Valley virus，SVV），又稱為 Senecavirus A（SVA），是豬原（yuán）發性皰疹病（Swine idiopathic vesicular disease，SIVD）的主（zhǔ）要病原。SVV 感染（rǎn）豬群（qún）後，盡管不會造成與口蹄疫病毒相同的較大政治、經濟損失，但所引起的水皰性病變，與口蹄疫、豬水泡病、水泡性口炎、豬水皰疹等造成的病變相似，給臨（lín）床鑒別診斷（duàn）造成（chéng）了一定（dìng）的困難。目前，北美、南美地區以及澳大利亞都有豬群發生（shēng） SIVD 的報道（dào）。我國於 2016 年也首次分離到了 SVV。目前，國內外已經開發了RT-PCR、熒光定量 PCR、ELISA 等 SVV 實驗室診斷方法，但（dàn）上述方（fāng）法操（cāo）作繁（fán）瑣，需（xū）依賴昂貴的儀（yí）器，且（qiě）耗時較長（2 h 以上）。本研究采（cǎi）用的重組酶聚（jù）合酶（méi）等溫擴增技術（shù）（Recombinase polymeraseamplification，RPA）是（shì）近年（nián）來出現的恒溫、核酸快（kuài）速擴增技術，已廣泛用於病毒（dú）、細（xì）菌、寄生蟲診斷研究（jiū） 。在擴增反應中，重組酶首先與上下遊引物結合，尋找（zhǎo）、定位同源的雙鏈 DNA，進行鏈交（jiāo）換；聚（jù）合酶從上下遊引物（wù）的 3´ 端啟動模板合成，形成兩條雙鏈 DNA。該方法在 37~42 ℃，10~30 min，對核（hé）酸進（jìn）行特異性擴增，最低可（kě）檢測 1~1 000 個拷貝的 DNA 或 RNA 分（fèn）子。RPA 結果讀取方式多樣，可采用瓊脂糖凝膠電泳、實時熒光、側（cè）流層析試（shì）紙條的方式，如已成功建立了（le）犬細小病毒 2 型 RPA瓊脂糖凝膠電泳檢測方法、中東（dōng）呼吸綜合征冠狀病毒 RPA 實時熒光方法、賈第鞭毛蟲 RPA 側流（liú）層析試紙條檢測方法（fǎ）。目前（qián）國際上尚無采用實時熒（yíng）光 RPA 檢測 SVV 的報道。本研究建立了實時熒光RPA 檢（jiǎn）測方法（fǎ），為 SVV 快速診斷及防（fáng）控提供（gòng）了技術參考。

1　材（cái）料與方法

1.1 毒株及（jí）核酸

口蹄疫病毒（dú） O 型緬甸 98 株（zhū）（FMDV）cDNA、 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）CH-1R 株 cDNA、豬瘟病毒 C 株（CSFV）cDNA、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）CV777 株和豬傳染性胃腸炎（yán）病毒華毒株（zhū）（TGEV）cDNA，由本實驗室保存。

1.2 實時熒光 RPA 標準品（pǐn）的製備

根 據 NCBI 中登錄的 SVV 全基因序列（NC_011349.1），合成基因共 7.31 kb。全基因由上海生工生物工（gōng）程技術服務有限公司合（hé）成。選擇 BamH I 和（hé） EcoR I 酶切位點（diǎn），將目的（de）基因（yīn）克隆於 pUC19 載體中構建重組質粒 pUC19-SVV，載體為 pUC19，重組質粒濃度為 300 ng/μL，約為2.8×1010 拷（kǎo）貝數，作為實時熒光 RPA 標準品。

1.3　主要儀器（qì）和試劑

實時熒光（guāng） RPA 監測儀器 TwistaTM，購自TwistDX 公 司；2×Probe qPCR Mix 試劑盒， 購自 Takara 公 司；Twist Amp exo 試劑盒， 購自TwistDX 公司（sī）。

1.4　引物和探針（zhēn）設計

根據（jù） NCBI 中登錄的 SVV 3D 基因序列（NC_011349.1），分別使用 Primer 5.0 軟件設計3 組引（yǐn）物和探針，分別為：組合 1（P-1），包括F1、R1、Pb1；組合 2（P-2）， 包括 F2、R2a、Pb2；組合（hé） 3（P-3），包括 F2、R2b、Pb2（表 1）。將探針和引物進一步通過 NCBI 的 BLAST 進行序列比對分析，比較設計的探針和引物序列（liè）與主（zhǔ）要 豬 病 病 毒（FMDV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV）的（de）序列匹配（pèi）度，確定引物和探（tàn）針的特異性，由上海生工生物工程（chéng）技術服務有限公司合成。

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