大腸杆菌的（de）常規分離鑒定方法

在（zài）獸醫臨診或實驗中，需做分離鑒定的大（dà）腸杆菌多限於一些對畜禽有致病性的菌株，如（rú）引起初（chū）生幼畜（chù）(仔豬、犢牛、羔羊)兼或斷奶豬（zhū）腹瀉的ETEC菌株、致豬水腫病和幼兔腹瀉以（yǐ）及雞各種大腸杆菌感染症的病原（yuán）性（xìng）菌株。除對分離菌做生物化學分型鑒定和血清學分型鑒定外，還應包括對ETEC黏附素抗原和腸毒素的鑒定，對水腫病菌株的SLT-Ⅱ有條（tiáo）件時也可以進行測定。至於對雞、兔和（hé）豬水腫病的菌株的（de）菌毛鑒定（dìng）且前尚處於實驗室研究階段。

1.形態（tài）和培養特征

致水腫病和新生仔豬（zhū）腹瀉的大多數菌株可呈溶血，在麥（mài）康凱瓊脂上形成紅色菌落，伊紅美藍瓊脂（zhī）上為中心暗藍黑色並有綠色金屬閃光的菌落。

2.生化鑒定

凡被檢菌落的細（xì）菌在三糖鐵瓊脂(TST)的反應為陽性者（zhě），在O抗原鑒定（dìng）為陽性或與此同時進（jìn）行常規生化項目（mù）鑒定亦符合埃希菌（jun1）屬的生化特性後（hòu），方可（kě）繼續作進一步血清學定型和毒性因子測定。

已知有97％分離出的（de）大腸杆菌產生葡（pú）萄糖苷酸酶，此酶能使葡萄糖苷酸-4-甲基傘形花烯(MUG)分解而生成熒光（guāng）性甲基傘形花酮，可用作快速檢（jiǎn）測（cè）。Thompson(1990)的快速（sù）法可於2Omin內完成。將應試大（dà）腸杆菌培養於哥倫（lún）比亞瓊脂基礎(Oxoid，含5％的綿羊（yáng）血)，在36℃孵育（yù）18-24h。

MUG試劑：4-甲基傘（sǎn）形（xíng）花烯寸-D葡萄糖苷酸1OOmg，蒸餾水1OOml，三通(TritoxX-1OO)2滴，待完全溶（róng）化，用O．45tzm孑L徑濾膜行（háng）濾（lǜ）過滅菌，儲（chǔ）於無菌（jun1）玻瓶內，在（zài）冰箱中可保存6月。在冰箱中溶液清澄，在室溫中微濁。

試驗：用6mmX 5Omm試管作培養。滴2-3滴(約0．5m1)MUG試劑於試（shì）管中，加熱到室溫，用（yòng）一無菌（jun1）接種棒刮下一部分純培養（yǎng）物在MUG試劑中乳化，使呈乳樣懸劑。在44．5℃水浴中孵育2Omin，此溫度可產生最強反應；但在22～44．5℃之間均可（kě）有滿意的（de）反應（yīng）。次用高強度（dù）長（zhǎng）波長(366nm)紫（zǐ）外線燈在（zài）暗（àn）室內檢視，置試管（guǎn）於光（guāng）源下15cm處，易於觀察（chá）。陽性者（zhě）發出青色熒光。

同樣原理，葡萄糖（táng）苷（gān）酸亦（yì）可和其他各種產（chǎn）熒光性（xìng）試劑結合，供檢測葡萄糖苷酶酸酶。

3.血（xuè）清（qīng）型鑒定

大腸杆菌目（mù）前有（yǒu）164個O抗原(O1～O171)、72個K抗原(K1～K1O3)和55個（gè）H抗（kàng）原(H1～H57)，已發現的血清型至少有幾千種。因此（cǐ），該菌的血清型鑒定是以O抗原、K抗（kàng）原、H抗原三種抗原（yuán）作為基礎的，對（duì）ETEC菌株還必須增做黏附素抗原的（de）鑒定。鑒於ETEC和EPEC均常局限於少數O抗原群，且前者的O抗原群又與黏附素及腸毒素（sù）之間存在一定的（de）相關性。

因此通常對動物ETEC和豬水腫病及禽大腸杆（gǎn）菌（jun1）病的菌株可先確定其O抗原（yuán）型，然後（hòu）做完全的血清型（xíng）鑒定。鑒定O抗原（yuán）的抗血清必須用單因子抗()血清，以免發生交叉反應。若使用非單因子血清應以試管凝（níng）集的反應結果來（lái）判定。

4.ETEC毒力因子的鑒定

和幼（yòu）畜腹瀉有關的（de）大腸杆菌（jun1）分離物在（zài）上述生化和血清型(至少是O抗（kàng）原)鑒定證實為（wéi）本菌後，再鑒定其（qí）是否具有黏附素抗原（yuán）和腸毒素。對（duì）腸毒素的鑒定可根據黏附（fù）素與腸毒素關係選擇適當的方法。通常，牛、羊源（yuán）菌原隻（zhī）產ST，而豬源菌株多產LT和ST。鑒定黏附素的方法很多，一般實驗室多（duō）用玻板凝集試（shì）驗、熒光抗體技術、ELISA和MRHA及其（qí）抑製試驗等方法。鑒定腸毒素的方法常用的為兔回腸結紮試驗或仔豬小腸結紮（zhā）試（shì）驗（yàn）、兔皮膚藍斑試驗以及平板免（miǎn）疫溶血試驗等（děng）。對ST的動物試驗隻有乳鼠（shǔ）胃內投服試驗可用。豬水腫病菌（jun1）株的SLT-Ⅱ的鑒定（dìng）目（mù）前仍以Vero細（xì）胞測定法為（wéi）主。