非（fēi）洲豬瘟病（bìng）毒實時熒光PCR檢測方法（fǎ）（團體標準）

團（tuán）體標準T/CVMA 5—2018

非洲豬瘟病（bìng）毒（dú）實時熒光PCR檢測方法

Real-time PCR assay for detection ofAfrican swine fever virus

前言

本標（biāo）準按 GB/T 1.1-2009給（gěi）出（chū）的規則起（qǐ）草。

本標準由中國獸醫協會提出並歸口。

本標準起（qǐ）草單（dān）位：中國動（dòng）物疫病預防控製中心（xīn）、中（zhōng）國獸（shòu）醫藥品（pǐn）監察所、中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所、中國農業（yè）科學院蘭州獸醫研究所、北京海關（guān）。

本標準主要起草人：倪建強、王傳彬、王琴、仇華吉、殷宏、楊林、辛盛鵬、劉豔華、劉洋、宋曉暉、趙（zhào）啟祖、羅玉子、劉誌傑、張（zhāng）乾義（yì）、喬彩霞、夏應菊、楊吉飛（fēi）、徐璐、顧小雪、亢文華、李碩、畢一（yī）鳴。

非（fēi）洲豬瘟病毒實時熒光（guāng）PCR檢測方法

1、範圍

本標（biāo）準規定了非洲豬（zhū）瘟病毒實（shí）時（shí）熒光PCR檢測（cè）方法的試劑、儀器和耗材、操作（zuò）步驟、結果（guǒ）判定、實驗室生物安全等技術要求。

本標準適用於豬脾髒、淋巴結、血液等組織和血（xuè）粉中（zhōng）非洲豬瘟病毒核酸的檢測。

2、規範性引用文（wén）件

下列文件對於本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅（jǐn）注日期的版本適用於本文（wén）件。凡是（shì）不注日期的（de）引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用於本文件（jiàn）。

GB 19489 實驗室 生物安全通（tōng）用要求

NY/T 541 獸（shòu）醫診斷樣品采集、保存與運輸技術規（guī）範

3、試劑

3.1 DNA提取試劑

DNA提取試劑的配製見附錄A，或選取商（shāng）品化的（de）病毒DNA提取試劑盒並參照說明書進行DNA提取。

3.2 2 × PCR緩（huǎn）衝液

2 × PCR緩衝液的配製（zhì）見附（fù）錄A。

3.3 引物探針

3.3.1 采用針對非洲豬瘟病毒VP72基因（核苷酸序列見附錄B）的引物（wù）及（jí）探針：

上遊引物（wù）ASF-CADC-rPCRF：5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3'

下遊引物ASF-CADC-rPCRR：5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3'

熒（yíng）光探針ASF-CADC-Probe：5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-1653-3'

3.3.2 可以（yǐ）使用世界動物（wù）衛生組織（OIE）在陸生動物診斷技術和疫苗手冊（Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals）第2.8.1章African Swine Fever中提供的引（yǐn）物和探針，並按照手冊中規定的檢測程序和判定標（biāo）準操作：

上遊（yóu）引（yǐn）物ASF-OIE-rPCRF：5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3'

下遊引物ASF-OIE-rPCRR：

5'-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-1876-3'

熒光探針ASF-OIE-Probe：

5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'

3.3.3 使用國家農業行政主管部門批準的（de）其他引物、探（tàn）針，應對檢測（cè）程序和判定標準作（zuò）相應調整。

3.4 陰性及陽性對照

陰性及（jí）陽性對照的製備方法見附錄C。

3.5 其（qí）他試劑

消毒液、5U/μLTaq DNA聚合酶（méi）、無（wú）菌無核酸酶水、0.01mol/L PBS（pH7.2）。

消毒液配製（zhì）見附錄A， 0.01mol/L PBS配製見附錄A。

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